IGF-1 Wirkung: Long R3 IGF-I in serumfreier Zellkultur

Long R3 IGF-I unterscheidet sich an zwei Stellen von IGF-I. In der rekombinanten Arbeit von King et al. aus dem Jahr 1992 wurde Glutaminsäure an Position 3 durch Arginin ersetzt. Die Autoren stellten [Arg3]-IGF-I neben [Gly3]-IGF-I her und charakterisierten beide Varianten. Sie deuteten deren verringerte Bindung an IGF-Bindungsproteine als wahrscheinliche Erklärung für das im untersuchten System abweichende Verhalten. Diese Deutung betrifft das Bindungsverhalten der Varianten; sie ist keine pauschale Aussage über andere Messgrößen (rekombinantes Expressionssystem in Escherichia coli, PMID 1311930).

Hinzu kommt ein eigenständiges N-terminales Verlängerungspeptid. Bryant et al. lokalisierten die Bindung Leu10–Phe11 innerhalb dieses abgrenzbaren Sequenzstücks und weitere Bindungen innerhalb der IGF-I-Einheit. Damit ist die Verlängerung als eigener Sequenzabschnitt belegt (Proteincharakterisierung des N-terminal verlängerten Analogons, PMID 8919033). Die verbreitete Angabe „13 Aminosäurereste“ steht in keinem dieser Belege — die genaue Länge gehört in den Stoffdatensatz des jeweiligen Materials, nicht in einen Studienverweis.

King et al. erzeugten IGF-I und die beiden Varianten rekombinant in Escherichia coli als Fusionsproteine. Die Aufarbeitung führte über isolierte Einschlusskörper, die Spaltung an der Asn-Gly-Bindung, Rückfaltung und Reinigung. HPLC und N-terminale Sequenzanalyse dienten in dieser Arbeit zum Reinheitsnachweis. Damit stehen seit dieser Arbeit dieselben Prüfverfahren im Zentrum, mit denen die Identität eines solchen Materials festgestellt wird. Sie begründen keine allgemeine Zusage für andere Materialien oder Chargen (rekombinantes Expressionssystem in Escherichia coli, PMID 1311930).

Ein analytischer Fallbericht zeigt, weshalb die Frage nach der IGF-1 Wirkung nicht beim Namen auf dem Etikett beginnen darf. Ein Analytiklabor identifizierte unter der Bezeichnung Long-R3-IGF-I ein Molekül mit einem His6-Tag am C-Terminus. Der Tag war über die Linker-Aminosäuren Leu-Glu angehängt. Zum Nachweis dienten Immunaffinitäts-Aufreinigung, nano-UPLC, hochauflösende Massenspektrometrie am intakten und am tryptisch gespaltenen Protein sowie ELISA (analytischer Fallbericht, PMID 20675162).

Die Autoren ordnen His-Tags als Hilfen bei der Aufreinigung ein. Bei N-terminaler Position werden sie anschließend enzymatisch entfernt. Der im Fallbericht am C-Terminus verbliebene Tag kennzeichnet daher ein Molekül, das sich vom nicht getaggten Long R3 IGF-I unterscheidet. Unter derselben Bezeichnung kann somit ein anderes Molekül im Umlauf sein. Der Name auf dem Etikett ist keine Stoffidentität; die Identität kommt aus dem Analysenbefund der Charge. Für Reinheit und Gehalt gibt es deshalb keine stoffübergreifende Pauschalaussage: Maßgeblich ist die zugehörige Chargendokumentation.

Im selben Expressionssystem entstanden zwei Varianten, bei denen Glu an Position 3 gegen Gly beziehungsweise Arg ausgetauscht war: [Gly3]-IGF-I und [Arg3]-IGF-I. Beide banden sehr schlecht an bovines IGF-Bindungsprotein-2. Am Typ-1-Rezeptor aus Ratten-L6-Myoblasten war ihre Bindung dagegen etwas schwächer als die von IGF-I. Die Autoren deuteten diese Kombination so: Nicht eine erhöhte Rezeptorbindung, sondern die verringerte Bindung an IGF-Bindungsproteine erkläre wahrscheinlich das abweichende Verhalten der Varianten. Damit ist ein Bindungsprinzip beschrieben; alle weiteren Aussagen benötigen den jeweiligen Versuchsaufbau und dessen Messgrößen (Rezeptor- und Bindungsproteinversuche, Ratten-L6-Myoblasten und bovines IGF-Bindungsprotein-2, PMID 1311930).

Für die Einordnung der IGF-1 Wirkung ist deshalb entscheidend, Rezeptorbindung und Rezeptoraktivierung auseinanderzuhalten. Die Arbeit von 1992 bestimmte die Bindung an ein Rezeptorpräparat aus Ratten-L6-Myoblasten. Die Arbeit von 2006 erfasste dagegen die Aktivierung von Rezeptoren in lebenden HEK293-Zellen, in deren Kultursystem auch Bindungsproteine vorhanden waren. Eine etwas schwächere Bindung im ersten Aufbau und eine höhere Aktivierung bei niedrigeren Konzentrationen im zweiten Aufbau bilden daher keinen sachlichen Widerspruch. Die Ergebnisse stehen nebeneinander, beschreiben aber verschiedene Messebenen und werden nicht zu einer gemeinsamen Aussage verschmolzen.

Ein serumfreies Medium legt seine Zusammensetzung fest, statt sie von einer Serumcharge abhängig zu machen. Für Wachstum und Viabilität kann daher ein definierter Zusatz erforderlich sein. Ob das tatsächlich der Fall ist, entscheidet jedoch die Zelllinie unter den dokumentierten Kulturbedingungen.

Das zeigt der Vergleich der serumfreien CHO-Zelllinien VA12 und CL23. Beide exprimierten jeweils ein rekombinantes Protein; bei beiden Produkten handelte es sich um rekombinante Zytokinrezeptoren. VA12 wuchs auch ohne Wachstumsfaktor, während CL23 für das Zellwachstum entweder Insulin oder LongR3 benötigte. Unter Produktionsbedingungen brauchten beide Linien einen Wachstumsfaktor; dort blieb ihre Viabilität mit LongR3 besser erhalten als mit Insulin. Die Anforderungen im gewöhnlichen Wachstum und unter Produktionsbedingungen waren also nicht deckungsgleich. Schon zwei Linien derselben Spezies verhielten sich unterschiedlich. Der Befund gehört zu diesen Zelllinien und Bedingungen, nicht pauschal zum Stoff (serumfreie CHO-Kultur, Zelllinien VA12 und CL23, PMID 11027158).

LongR3IGF-I wurde für die Proteinproduktion in Säugetierzellen entwickelt. In serumfreier CHO-Kultur trug es Wachstum und Überleben bei mindestens 200-fach niedrigerer Konzentration als Insulin. Diese Zahl bezeichnet ausschließlich die im Kultursystem verglichenen Konzentrationen. In HEK293-Zellen aktivierten alle untersuchten Mitogene sowohl den Typ-I-IGF-Rezeptor als auch den Insulinrezeptor konzentrationsabhängig. Unter LongR3IGF-I lag die Aktivierung beider Rezeptoren bei niedrigeren Konzentrationen höher als unter den Vergleichssubstanzen (serumfreie Zellkultur, HEK293 und CHO, PMID 17172665).

Die Autoren führten die höhere Aktivierung des Insulinrezeptors trotz niedriger Affinität zu diesem Rezeptor als Hinweis auf heterotetramere IGF-IR/IR-Dimere an. Auch die Abnahme der IGF-IR-Aktivierung bei höheren LongR3IGF-I-Konzentrationen ordneten sie nur als Hinweis ein: Die Konzentrations-Wirkungs-Kurve könne glockenförmig verlaufen. Dieser Rückgang widerspricht gerade der Erwartung „mehr Zusatz, mehr Antwort“. Eine steigende Konzentration ging in diesem Messbereich somit nicht durchgehend mit einer steigenden IGF-IR-Aktivierung einher. Beide Punkte sind Deutungen der Autoren zu diesem HEK293-System, keine eigenständigen Stoffeigenschaften. Weitere Grundlagen zur Trennung von Versuchsaufbau und Aussageebene bietet die Übersicht zu Modellqualifiern und Studienlage.

Bei in vitro erzeugten Rinderembryonen wurde die Affinität von Long R3 IGF-I zu IGF-Bindungsproteinen mit Kompetitionsassays und Western-Ligand-Blots bestimmt. Sie lag mindestens drei Größenordnungen unter der Affinität von IGF-I. Die Gesamtzellzahl der Blastozysten war in der Gruppe, der das Analogon zugesetzt wurde, mit 105 ± 4 am höchsten; für IGF-I wurden 96 ± 5 und für die Kontrolle 91 ± 3 erfasst (P < 0,05). Der Unterschied entfiel im Wesentlichen auf die Trophektoderm-Zellzahlen. Damit beschreibt die Differenz keine gleichmäßige Verschiebung sämtlicher Zellanteile der Blastozyste. Sie ist an die differenzielle Zellfärbung und die im Versuchsaufbau getrennt ausgewiesene Zellpopulation gebunden. Diese Messreihe verbindet das abweichende Bindungsverhalten mit konkreten, aber eng modellgebundenen Endpunkten (in vitro erzeugte Rinderembryonen, PMID 11181549).

Auch die Transkriptdaten verliefen nicht einheitlich. Die IGFBP-2-mRNA lag in der Gruppe, der das Analogon zugesetzt wurde, 1,7-fach über der IGF-I-Gruppe und 2,8-fach über der Kontrolle. Die IGF-I-Rezeptor-mRNA war unter IGF-I auf 80 % der Kontrolle vermindert, unter dem Analogon dagegen 1,3-fach erhöht. Die Autoren folgerten, dass die Affinität zu IGF-Bindungsproteinen für die beobachteten Größen relevant ist, sich auf verschiedene Parameter jedoch in verschiedene Richtungen auswirkt. Zellzahl, IGFBP-2-mRNA und Rezeptor-mRNA sind deshalb nicht zu einem einzigen Verlauf zusammenzufassen. Schon innerhalb desselben Versuchs stehen somit mehrere Ausleseebenen nebeneinander: eine Zellzählung, die Verteilung auf einen Zelltyp und relative mRNA-Mengen. Die Zahlen beantworten jeweils eine andere Frage. Dass ein Wert gegenüber einer Vergleichsgruppe höher liegt, legt weder die Richtung eines anderen Endpunkts fest noch macht es die Messgrößen austauschbar.

Einen notwendigen Gegenpunkt liefert das über sieben Tage untersuchte Tiermodell Meerschweinchen. Die Autoren führten Long R3 IGF-I als Analogon mit deutlich verringerten Affinitäten zu IGF-Bindungsproteinen ein. Körpergewichtszunahme, Futteraufnahme, Futterverwertung und Schlachtkörperzusammensetzung wurden durch keine Gruppe signifikant beeinflusst. Zugleich nahmen unter dem Analogon die relativen Gewichte von Nebennieren, Darm, Nieren und Milz zu; ein Gesamtwachstum wurde ausdrücklich nicht angeregt. Die Organmessungen und die unveränderten Gesamtgrößen gehören gemeinsam zum Ergebnis. Nur eine Seite davon hervorzuheben, würde den Befund verzerren. Ein Molekül, das ein Kultursystem bei sehr niedriger Konzentration trägt, erzeugt im vollständigen Organismus somit kein gleichförmiges Mehr (Tiermodell Meerschweinchen, PMID 7561636).

Was über die IGF-1 Wirkung belegt ist, endet an den Grenzen des jeweiligen Versuchsaufbaus. Serumfreie Säugerzellkultur, in vitro erzeugte Rinderembryonen, das Tiermodell Meerschweinchen und ein analytischer Fallbericht am Material selbst sind vier getrennte Modellsysteme; ihre Befunde addieren sich nicht zu einem gemeinsamen Bild. Beobachtungen am körpereigenen Wachstumsfaktor gehen nicht automatisch auf ein strukturell verändertes Analogon über, und der umgekehrte Schluss ist ebenso wenig gedeckt. Der Korpus trägt keine Aussage für Menschen. Im analytischen Fallbericht halten Kohler et al. ausdrücklich fest, dass Effekte des dort gefundenen His-getaggten Moleküls nicht untersucht sind (analytischer Fallbericht, PMID 20675162). Das ist eine Beleglücke und keine übertragbare Aussage zu anders dokumentiertem Material. Für die Einordnung bleiben Stoffidentität, konkrete Charge, Modell, Messverfahren und Endpunkt getrennt zu prüfen. Weitere sachliche Abgrenzungen stehen in den weiteren Einträgen im Glossar.

• King R et al. (1992), J Mol Endocrinol 8(1):29–41, PMID 1311930, DOI 10.1677/jme.0.0080029. Modellqualifier: rekombinante Herstellung in Escherichia coli und Ratten-L6-Myoblasten.
• Bryant KJ et al. (1996), Growth Factors 13(3–4):261–272, „Design and characterisation of long-R3-insulin-like growth factor-I muteins which show resistance to pepsin digestion“, PMID 8919033, DOI 10.3109/08977199609003227. Modellqualifier: Strukturanalyse eines N-terminal verlängerten IGF-I-Analogons.
• Morris AE, Schmid J (2000), Biotechnol Prog 16(5):693–697, PMID 11027158, DOI 10.1021/bp0000914. Modellqualifier: serumfreie Zellkultur, CHO-Zelllinien VA12 und CL23.
• Prelle K et al. (2001), Endocrinology 142(3):1309–1316, PMID 11181549, DOI 10.1210/endo.142.3.8038. Modellqualifier: in vitro erzeugte Rinderembryonen. Erratum: Endocrinology 2001 May;142(5):1702.
• Voorhamme D, Yandell CA (2006), Mol Biotechnol 34(2):201–204, PMID 17172665, DOI 10.1385/mb:34:2:201. Modellqualifier: serumfreie Zellkultur, HEK293 und CHO.
• Conlon MA et al. (1995), J Endocrinol 146(2):247–253, PMID 7561636, DOI 10.1677/joe.0.1460247. Modellqualifier: Tiermodell Meerschweinchen, sieben Tage.
• Kohler M et al. (2010), Growth Horm IGF Res 20(5):386–390, „Detection of His-tagged Long-R³-IGF-I in a black market product.“, PMID 20675162, DOI 10.1016/j.ghir.2010.07.001. Modellqualifier: analytischer Fallbericht.